| 操作要点：①取新鲜毛蚶肉，蒸煮后绞碎，与其澄清后的煮汁一并使用，用硫酸调节至pH 2.5，煮沸0.5小时左右，滤去沉淀物。②向滤液中加1％的活性炭，搅拌2小时，滤去清液，滤液再用活性炭吸附1次，合并两次经过吸附的活性炭，加入2倍量的酸水搅拌15分钟，除去沾在活性炭上的杂质。滤去液体，用碳酸钠调节至pH 9.5，再加入1％的亚硝酸钠，加热搅拌2小时过滤。③洗脱液中加入1％亚硝酸钠和20％正丁醇不断搅拌，同时加热至60～70℃保持2小时，如溶液有大量蛋白质析出，将析出蛋白质滤去，再加入硫酸铵至饱和，搅拌并加热至65～75℃保持1小时。④静置，待液体分层后，分出正丁醇溶液，再用盐酸调节至pH 2.5，然后用0.1摩／升盐酸提取7～8次，将抽提液用碳酸钠调节pH为4.5～5.0。⑤将上述溶液用碳酸钠调节pH 8.5，在通风橱中缓慢加入0.7％氰化物，搅拌均匀后，置于暗处约5小时，氰化即可完成。⑥向氰化液中加入食盐，使溶液呈饱和状态，用酚-丁醇混合液抽提数次。二氰络合物即溶解于有机溶剂层。抽提液中加入等量三氯甲烷，充分搅拌，并用蒸馏水抽提。再在水抽提液中加入四氯化碳和蒸馏水抽提。最后水抽提液用乙醚洗涤，即得到较纯的玫瑰红溶液。⑦将两倍体积的丙酮加入活化后的氧化铝搅拌，静置。待氧化铝沉降倾出上层丙酮，另加入1倍体积丙酮，倒入层析柱中。向浓维生素B12溶液中加入3倍体积的纯丙酮混合均匀后，灌人层析柱。待全部溶液通过后，再以80％丙酮溶液洗涤吸附柱。在冲洗过程中，层析柱上即分离出不同颜色环，最上一环为黄褐色，第二环为橙红色，最下一环为桃红色，即为维生素B12。随着时间的延长，各环的分离也愈完全。在桃红色环降至层析柱2／3处时，改用50％丙酮水溶液洗脱，收集桃红色洗脱液，在水溶锅中加热浓缩至原体积的1／8。⑧在浓缩液中加入10倍量纯丙酮混合均匀，把溶液置于5℃冷库中放置2天，维生素B12 即逐渐结晶成玫瑰红色的针状或棱柱状的晶体，待母液的红色极淡时，倒出母液，用丙酮洗涤结晶数次，再用乙醚洗涤，在真空干燥箱中避光干燥。 |
